韩继成,陈霜莹,章德明

(河北省农林科学院昌黎果树研究所,河北昌黎　066600)

摘要:以昌红、红世界、红金和群红4个无病毒苹果无性系为试材,用PhytagelR代替琼脂 作为固化剂,研究了N6、MS和NN69培养基上附加0·5mg/L的IBA以及各培养基处理的 不同培养方法对其离体叶片植株再生效率的影响。结果表明,NN69培养基优于MS和N6培 养基,再生率最高可达到100%;IBA对植株再生有促进作用;暗培养有利于离体叶片植株 再生。

关键词:苹果;叶片;再生

中图分类号:S661·1　文献标识码:A

苹果存在童期长、自交不亲和、杂交程度高等问题,常规育种对其进行改良比较困难,因此遗传 转化技术可成为苹果品种改良的有效辅助手段,而高效再生体系的建立是遗传转化的必要前提。国内 已对苹果离体叶片再生植株研究进行了广泛报导[1~9],目前所用基本培养基为MS、1/2MS、N6、B5 和NM。我们在葡萄离体叶片植株再生及遗传转化研究过程中认为NN69(NitchandNitch1969)是适 于葡萄叶片再生植株的基本培养基[10,11],而在苹果离体叶片再生植株的研究中尚无人使用,同时, PhytagelR(SIGMA)作为一种新的培养基固化剂,具有显著的防褐化作用,在酚类物质含量较多的棉 花以及果树的组培快繁中都有应用。我们就此采用无病毒苹果试管无性系离体叶片进行植株再生的初 步研究。

1　材料与方法

1·1　材料

苹果无病毒试管无性系昌红、红世界、红金和群红,均由河北省农林科学院昌黎果树研究所提供。 苹果无病毒试管无性系保存和继代培养基为MS培养基附加BA1·2mg/L、NAA0·05mg/L、糖 30g/L、CH100mg/L和琼脂5·5g/L。

1·2　方法

离体叶片再生植株时分别用低浓度无机盐的N6、中度浓度无机盐的NN69和高浓度无机盐的M 培养基,培养基中附加TDZ1·0mg/L、CH250mg/L、糖30g/L和PhytagelR2·0g/L。每种培养基再 分别设置附加IBA0·5mg/L或不加IBA2个处理。

在(25±1)℃/光照,(19±1)℃/黑暗,光照时间12h的培养室中进行保存和继代培养。离体叶 片再生植株时,选择健壮的试管苗顶部1~2个幼嫩平展的叶片,用刀割伤后以近轴面和培养基接触 的方式进行植株再生试验。直接在上述培养室中进行光培养或遮光暗培养2周后再进行光培养。 叶片在再生培养基上培养2个月后,统计再生植株和植体再生芽数量,计算再生频率和外植体再 生芽数[2]。再生频率(%)=(再生不定芽芽外植体数/调查外植体数)×100%。外植体平均再生 芽数(个)=外植体再生不定芽总数/再生不定芽的外植体数。

2　结果与分析

2·1　基本培养基对植株再生的影响

中度浓度无机盐的NN69培养基优于高浓度无机盐的MS培养基和低浓度无机盐的N6培养基 (表1)。

2·2　IBA对植株再生的影响

除群红外,其余3个品种在未加IBA的培养基中也不同程度地再生出植株,但不同的基因型和培 养基,表现作用不一致,总体而言,IBA对苹果离体叶片的植株再生有促进作用,并且可以提高再生 植株的质量(表1)。

2·3　培养条件对植株再生的影响

除群红在无暗培养处理下没有再生出植株外,其余3个品种均不同程度的出现植株再生(表1)。 表明苹果离体叶片进行植株再生时,暗培养虽有助于植株的再生,但并不是绝对的。

3　讨论

在苹果离体叶片再生植株的研究中,作为内因的基因型材料,再生能力存在显著差异,并且因基 因型的不同,其培养条件也有一定差异。因此,在进行特定基因型的植株再生及遗传转化时,进行再 生的培养基和培养条件的筛选是有益的[4,12]。当然,具有相同基因型背景的材料,培养中表现相似, 可作为参考。

在外因中,激素的种类及其配比无疑是最重要的影响因子。TDZ更适合于苹果离体叶片的植株再 生,并且其作用浓度范围较宽[2,3],同时TDZ具有弱的IBA活性。在试验的4个品种中,除群红外, 其余3个品种在未加IBA的培养基中也不同程度地再生出植株,但不同基因型、不同培养基其表现不 一致。总体而言,IBA对苹果离体叶片的植株再生有促进作用。

取材部位的细胞分裂能力越强,越处于分化初期,其再生能力越强[8]。因此,取材部位和继代 时间对离体叶片的再生亦有影响[7]。刘莹等[13]在苹果矮化砧木P59离体叶片再生植株研究中选用苗龄 20~30d的试管苗,建立了良好的再生体系。因此,在用苹果离体叶片再生植株时一般选用幼嫩叶片 (或叶段)离体培养,更易于分化再生植株[14]。选取叶片时,根据继代时腋芽已开始大量萌发,叶片 呈鲜绿状态作为植株再生的材料,获得了较好效果。因此视材料的长势确定取材时间似乎更合理,因 为继代过程中的培养条件和激素配比对试材的理化状态有一定影响,而叶片接种前所处的生理生化状 态对其再生芽的能力有很大影响[1,7]。

PhytagelR作为一种新的培养基固化剂,具有显著的防褐化作用,在酚类物质含量较多的棉花以 及果树的组培快繁的应用中效果显著。该观点在我们的试验中也得到了证实。

吴禄平等[1]认为叶片接种后立即进行一段时间的暗培养是必需的,然而在试验中,暗培养虽然 可明显提高不定芽再生率,但不是必需的。

参考文献:

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[13]刘　莹,徐继忠,邵建柱,等·苹果矮化砧木P59离体叶片高效再生体系的建立[J]·2006,29(3):10-13·

[14]赵政阳,曹晓玲,黄　英,等·叶片成熟度对苹果试管苗叶片再生植株的影响[J]·陕西农业科学,1997, (1):20-21· [责任编辑　杜晓东]