黄少伟  池汝安  张越非  吴元欣  巨修炼  郭嘉  黄齐茂

(武汉工程大学化工与制药学院湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室,湖北武汉430073

[摘要]目的:研究大孔吸附树脂分离纯化土茯苓总黄酮的工艺条件。方法:以土茯苓总黄酮收率为指标,通 过考察静态和动态吸附实验,筛选了大孔吸附树脂分离纯化土茯苓总黄酮的最佳工艺条件。结果:D101大孔树脂 对土茯苓总黄酮的静态饱和吸附容量为45·6 mg·g-1(干树脂);最佳动态吸附、洗脱条件为土茯苓总黄酮提取液 pH 6·00±0·20,质量浓度4·2 mg·mL-1,吸附流速2 mL·min-1,上样量15 mL;吸附后的树脂柱先以100 mL纯化 水洗脱后,再用100 mL pH 8·00±0·20的60%乙醇以3 mL·min-1流速洗脱。结论:D101型大孔树脂在所确定的 工艺条件下,可较好的分离纯化土茯苓总黄酮,其回收率达到90%以上,且纯化后土茯苓总黄酮含量达到62·6%, 是纯化前的近2倍。

[关键词]　土茯苓;总黄酮;大孔吸附树脂

[中图分类号]R 284. 1　[文献标识码]A　[文章编号]1001-5302(2008)10-1133-06

土茯苓为百合植物光叶菝葜SmilaxglabraRoxb 的干燥根,又名红土苓,主要产于广东、湖南、湖北等 地。甘、淡、平,归肝、胃经,是传统的清热解毒常用 中药,具有调中止泻、健脾胃、强筋骨、除湿、利关节 等功效,临床上用于治疗湿热淋浊、带下病、痛肿、瘰 疠、疥癣、梅毒及汞中毒所致肢体拘挛,筋骨疼痛等 症[1]。近年来临床和药理试验表明,土茯苓在抗 癌、抗动脉硬化和治疗冠心病、心绞痛等方面效果良 好;土茯苓对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、绿脓 杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、福氏痢疾杆菌、白喉杆 菌、炭疽杆菌等细菌有一定抑制作用[2, 3]。大孔吸 附树脂是20世纪70年代发展起来的吸附分离材 料,其吸附分离原理是机械筛分和化学吸附的综合。 它具有物理化学稳定性高,吸附选择性强,富集效果 好,解吸条件温和,再生简便,使用周期长等优点而 广泛应用于天然产物的分离和纯化[4-6]。作者通过 对土茯苓总黄酮的吸附分离研究,发现D101大孔 吸附树脂是一种对土茯苓总黄酮具有优良吸附性能 的吸附树脂,并得出优化的吸附分离工艺条件,其结 果可为土茯苓总黄酮的提取分离提供参考。

1　仪器与试药

土茯苓购于三九中药房,经湖北中药研究院王 克勤研究员鉴定;芦丁对照品购于中国药品生物制 品检定所(批号0080-9705); D101大孔树脂(天津 制胶厂);AB-8, S-8大孔树脂(南开大学);聚酰 胺(14~30目,国药集团化学试剂有限公司),其他 试剂均为国产分析纯。

UV-7504紫外-可见分光光度计(上海欣茂仪 器有限公司);玻璃色谱柱(30 mm×500 mm, 10 mm×150 mm)。

2　方法

2.1　标准曲线制备

总黄酮的分析采用分光光度法,以芦丁为对照 品,试样中加入铝离子试剂,同时控制适宜pH,使黄 酮化合物与铝盐形成络合物,在可见区能获得稳定 的特征吸收峰,可直接进行分光光度测定。

标准曲线的绘制[1]:精密称取105℃干燥至恒 重的芦丁对照品200·0 mg,置于100 mL量瓶中,加 适量80%乙醇溶液使其溶解,并稀释至刻度,摇匀, 为2·0 mg·mL-1。吸取该标准溶液0, 0·1, 0·2, 0·4, 0·6, 0·8, 1·0, 1·2, 1·4 mL分别置于10 mL量 瓶中,各加0·1 mol·L-1三氯化铝溶液2 mL, 1 mol ·L-1醋酸钾溶液3 mL,用60%乙醇溶液稀释至刻 度,摇匀后超声除气泡5min,再放置30min,同时作 空白,用UV-7504紫外-可见分光光度计在420 nm 波长处测定吸光度,质量浓度C(20 ~280μg· mL-1)与吸光度(A)有良好的线性关系。用最小二 乘法线性回归,以测定结果计算,得回归方程C= -0·519 76+313·467 96A(r=0·999 9)。

2.2　土茯苓总黄酮浓缩液的制备

将土茯苓饮片(1 kg)粉碎,石油醚(60~90℃) 回流脱脂后,再用80%乙醇回流提取多次,抽滤,合 并滤液,减压回收乙醇至无醇味,再加适量热水稀 释,抽滤(或离心),滤液(或上清夜)定容至1 000 mL(1 g·mL-1)即得样品液,测得总黄酮质量浓度 为8·4 mg·mL-1。

2·3　树脂的预处理

用无水乙醇浸泡并充分溶胀D101树脂,然后将树脂置于玻璃色谱柱(30 mm×500 mm)中用无水乙醇淋洗,检测流出液,直至淋洗后流出液与水混合(1∶5)后不再出现白色混浊,用大量重蒸水洗去乙醇至无醇味,然后分别用体积分数为5%的HC溶液、2%的NaOH溶液淋洗树脂,再用纯化水洗至 中性,密封存放,待用[7]。

2·4　树脂的静态吸附与解吸

准确称取经真空干燥的预处理树脂装入具塞磨口三角瓶中,加入土茯苓总黄酮提取液,置恒温震荡器上震荡,充分吸附后,过滤,测定滤液中平衡总黄 酮浓度。分别取已吸附饱和的树脂于具塞磨口三角 瓶中,加入解吸液振荡,充分解吸,然后取其过滤清液测定其平衡浓度。通过比较不同树脂的吸附量及解吸率,筛选出较优的吸附树脂,并研究了静态吸附动力学曲线,考察提取液及解吸液pH对树脂吸附性能的影响。

其中q为树脂的吸附容量(mg·g-1干树脂); E,D分别为吸附率和解吸率;ρ0为土茯苓总黄酮提 取液质量浓度(mg·mL-1);ρ1,ρ2分别为吸附后和 解吸后的滤液质量浓度(mg·mL-1);m为树脂质 量(g);V为解吸液体积(mL)。

2·5　树脂的动态吸附与解吸

由大孔吸附树脂对土茯苓总黄酮的静态吸附、 解吸试验,对筛选出的一种理想树脂,考察上样液的 流速、浓度以及洗脱剂的流速、浓度对树脂吸附和解吸性能的影响,进行动态吸附与解吸试验。把预处理好的树脂装入10mm×150mm玻璃色谱柱中(柱床体积约为9 mL),将土茯苓总黄酮提取液上柱,洗脱,分步收集洗脱液,检测洗脱液中土茯苓总黄酮浓度。

3　结果与分析

3.1　树脂的静态吸附与解吸结果

3.1.1　树脂的静态吸附动力学曲线在30℃恒温振荡器中,考察了D101,AB-8, S-8和聚酰胺4种树脂对土茯苓总黄酮吸附率和吸附时间的关系,绘出了静态吸附动力学曲线,其结果如图1所示。由图1可见,聚酰胺对土茯苓总黄酮的吸附最快,在 1·0 h内基本达到平衡;D101,AB-8和S-8吸附速率相当,基本上在3·0 h后达到平衡。

3.1.2　树脂的筛选　分别称取1·00 g(干重)经预 处理的D101, S-8,AB-8和聚酰胺树脂于50 mL 具塞磨口三角瓶中,加入30 mL(2·1 mg·mL-1)土茯苓总黄酮提取液,置于30℃恒温振荡器上振荡8 h,然后取其过滤滤液检测其浓度,计算树脂的单位饱和吸附容量q和吸附率E。分别将已吸附饱和的 不同树脂置于50 mL的具塞磨口三角瓶中,分别加 入30 mL 60%乙醇振荡8 h进行静态解吸,测定解吸液中土茯苓总黄酮浓度,计算解吸率D,结果见表 1。

在相同条件下,吸附树脂的种类不同,不但吸附 能力不同,其解吸能力也是不同的。实验表明,聚酰 胺吸附容量最大,达到70·3 mg·g-1干树脂,但是 其解吸率只有66·2%;非极性大孔树脂D101吸附 容量为56·8 mg·g-1,解吸率也达到90%以上。综合吸附和解吸效果以及静态吸附动力学试验,选择 D101大孔树脂做后续实验。

3.1.3　pH对树脂性能的影响　称取1·00 g(干 重)经预处理的D101树脂若干份置于50 mL具塞 磨口三角瓶中,分别加入30mL(质量浓度为2·1m ·mL-1)不同pH的土茯苓总黄酮提取液,置于3 ℃恒温振荡器上振荡8 h,然后取其过滤滤液检测其 浓度,考察土茯苓总黄酮提取液pH对D101树脂吸附性能的影响;选择吸附效果最优的饱和树脂进行 解吸实验,考察不同pH的60%乙醇解吸液对解吸性能的影响,结果见图2。

由图2可看出,吸附前提取液的pH小于7即 偏酸性时,D101大孔树脂对土茯苓总黄酮的吸附效果优于碱性条件;解吸剂的pH大于7即偏碱性时, 60%乙醇对土茯苓总黄酮在D101树脂上解吸效果优于酸性条件。这可能是因为土茯苓总黄酮类成分含有较多酚羟基,显弱酸性,在酸性条件下不易解离[8],以分子形式存在,而有利于总黄酮在大孔树脂上的吸附;在碱性条件下容易解离,以离子形式存在,从而易于总黄酮在树脂上的解吸。故选择吸附前提取液的pH在4~6、吸附后解吸液的pH 8~10 为佳。

3.2　树脂的动态吸附与解吸结果

3.2.1　上样液浓度的考察　称取2·0 g(干重)预 处理后的D101树脂湿法装于(10 mm×150 mm)色 谱柱中,将1·05, 2·1, 3·15, 4·2, 5·25, 6·3, 8·4 mg· mL-1的土茯苓总黄酮提取液(pH均调至6·00± 0·20)各100 mL分别以2·0 mL·min-1的流速通过树脂柱,室温下进行动态吸附,检测流出液中土茯苓 总黄酮浓度,计算树脂的吸附容量,结果见图3。

由图3可以看出,在一定浓度范围内,随上样液质量浓度增加,树脂对土茯苓总黄酮的吸附容量先 增加后减少。显然,在总黄酮低浓度区间,随着上样液质量浓度的提高,单位量树脂可吸附的总黄酮量增加,因而树脂吸附容量提高。但是,由于流速恒定,随总黄酮浓度的进一步提高,土茯苓总黄酮分子在树脂内部扩散能力可能降低,且浓度增加后,与总黄酮竞争树脂吸附位点的杂质量也会增加,因而树脂的目标吸附量反而会下降。故选择上样液质量 浓度在4·2 mg·mL-1左右为宜。

3.2.2　上样液流速的考察　称取2·0 g(干重)预 处理后的D101树脂湿法装于(10 mm×150 mm)色 谱柱中,将4·2 mg·mL-1的土茯苓总黄酮提取液 (pH 6·05)100 mL分别以1·0, 2·0, 3·0, 4·0, 5·0 mL·min-1的流速通过树脂柱,室温下进行动态吸 附,检测流出液中土茯苓总黄酮浓度,计算树脂的吸 附容量,结果见图4。

由图4可以看出,树脂的吸附容量随流速的增大而下降。原因可能要考虑到树脂的内扩散效应,当吸附流速过快,则溶液通过树脂床的速度大于传质速 度,总黄酮分子来不及扩散到树脂的内孔就已经流出柱子,传质未进行彻底,从而使得树脂的吸附容量减少。因此,在相同条件下,上样流速慢有利于土茯苓总黄酮的吸附,即当吸附流速为1 mL·min-1时吸附效果最好,但当吸附流速为2 mL·min-1时总黄酮的解吸率与流速为1 mL·min-1时相差不大,考虑工作效率,选择2mL·min-1的流速进行上柱。

3.2.3　上样量的考察　取质量浓度为4·2 mg· mL-1的土茯苓总黄酮提取液(pH 6·02),室温下以 流速2 mL·min-1加于D101树脂柱上,每10 mL收 集一管流出液,检测流出液中土茯苓总黄酮浓度,绘 制动态吸附透过曲线,结果见图5。

由图5可见,流出液中土茯苓总黄酮的含量随上样量增加而增加。上样量在10~20mL吸附透过曲线上升缓慢,此阶段为吸附过程;上样量超过20 mL后,吸附透过曲线陡然上升,饱和点为40 mL,此 时树脂柱完全吸附饱和。因此,为了减少泄漏,在提高土茯苓总黄酮的回收率的同时增大上样量,合适 的上样量选择在15 mL左右(此时动态吸附容量约 为29·3 mg·g-1)。

3.2.4　洗脱剂浓度的考察　取7份15 mL质量浓 度为4·2mg·mL-1(pH 6·07)土茯苓总黄酮提取液 以2 mL·min-1流速在室温下分2批上4根D101 树脂柱(10 mm×150 mm),收集泄漏液,检测土茯 苓总黄酮含量,从而计算出树脂柱的吸附量。树脂 柱分别用100 mL纯化水洗脱(实验发现用100 mL 水即可洗去水溶性杂质糖和蛋白质等),再分别用 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%乙醇(调节 pH 8·00±0·20)以3 mL·min-1流速洗脱,直至收 集的洗脱液紫外检测不出土茯苓总黄酮为止。分别 浓缩洗脱液回收乙醇,检测洗脱液中土茯苓总黄酮 含量,计算洗脱率,结果见表2。由表2可见, 60% 乙醇洗脱率最高,且洗脱剂用量较小,故确定60% 乙醇液为最佳洗脱剂。

3.2.5　洗脱剂流速的考察　取5份15 mL质量浓 度为4·2 mg·mL-1(pH 6·07)土茯苓提取液以2 mL·min-1流速在室温下分2批上3根D101树脂 柱(10 mm×150 mm),收集泄漏液,检测土茯苓总 黄酮含量,从而计算出树脂柱的吸附量。树脂柱分 别用100 mL纯化水洗脱,再用60%乙醇(调节pH 8·00±0·20)分别以1, 2, 3, 4, 5 mL·min-1的速度 洗脱,直至收集的洗脱液紫外检测不出土茯苓总黄 酮为止。分别浓缩洗脱液回收乙醇,检测洗脱液中 土茯苓总黄酮含量,计算洗脱率,结果见表3。

由表3可知,随着洗脱流速的增加,醇洗脱总黄 酮的量逐渐减少,且当洗脱剂流速较慢或较快时,洗 脱剂用量均较大。原因可能是洗脱流速过快,洗脱液 通过树脂床的速度大于传质速度,部分洗脱液可能未 起到解吸附作用而直接流出。因此,考虑到洗脱剂用 量和工作效率,选择洗脱剂流速为3mL·min-1。

3.2.6　洗脱终点的确定按上述确定的吸附条件, 将4·2mg·mL-1的土茯苓总黄酮提取液15 mL在室 温下上柱,吸附后,柱子先用100 mL纯化水洗脱,然后用60%乙醇(pH 8·12),以3 mL·min-1的流速进行洗脱,每10 mL收集1次洗脱液,检测洗脱液中土 茯苓总黄酮浓度,绘制动态洗脱曲线,结果见图6。

由图6可知,在乙醇用量为10~20 mL时,随着 乙醇用量的加大,流出液中土茯苓总黄酮的含量逐 渐增加;当乙醇用量继续加大时,流出液中土茯苓总 黄酮的浓度又逐渐的降低;当乙醇用量为80~100 mL时,已基本将土茯苓总黄酮洗净。

3.2.7　树脂重复使用次数的考察

按上述确定的 吸附洗脱条件,取上述土茯苓总黄酮提取液过柱,在同一根树脂柱上重复操作6次,分别计算6次的动 态吸附容量和土茯苓总黄酮回收率(过柱前土茯苓总黄酮量/过柱后土茯苓总黄酮量×100% ),结果见表4。

可看出,D101树脂重复使用4次后,对土茯苓 总黄酮的吸附量已经明显下降,需要再生才可以继续使用,故树脂可重复使用4次。

3.2.8　分离纯化后土茯苓总黄酮含量和回收率的 考察　合并优化吸附、洗脱工艺下的洗脱液,减压浓缩回收乙醇,低温真空烘干至恒重,得棕黄色粉末 (即土茯苓总黄酮)。精密称取50 mg经过D101大 孔树脂纯化过和未经纯化的土茯苓总黄酮粉末(直 接浓缩提取液真空干燥得到)各1份,分别用80% 乙醇使其溶解后定溶于50 mL量瓶中,摇匀。平行 取3份检测总黄酮含量,计算土茯苓总黄酮质量分 数(土茯苓总黄酮粉末中含所总黄酮量/土茯苓总 黄酮粉末量×100% )和回收率,结果纯化后土茯苓 总黄酮达到62·6%,比纯化前提高了近1倍,且回 收率达到95·7%。

4　结论

D101大孔吸附树脂对土茯苓总黄酮的静态饱 和吸附容量为45·6 mg·g-1(干树脂),静态解吸率为91·3%;动态吸附容量约为30 mg·g-1(干树 脂),动态洗脱率达94%以上。

动态吸附实验表明D101大孔吸附树脂对土茯 苓总黄酮具有良好的吸附性能。其工艺条件为:在室温下,将浓度为4·2 mg·mL-1(pH 6·00±0·20) 的土茯苓总黄酮提取液以2 mL·min-1流速上样, 先以100 mL纯化水洗脱吸附后的树脂柱后,再用60% (pH 8·00±0·20)的乙醇100 mL以3 mL· min-1流速洗脱。在此工艺条件下,土茯苓总黄酮回收率达到90%以上,且纯化后土茯苓总黄酮含量达 到62·6%,是纯化前的近2倍。

D101大孔吸附树脂对土茯苓总黄酮具有吸附 快、吸附容量大、解吸率高等优点,在分离纯化土茯苓总黄酮方法中具有一定的推广价值。

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